Otimização da expressão de uma serino protease da saliva do triatomíneo Rhodnius neglectus

Abstract

Os triatomíneos são os vetores do protozoário Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas. Estima-se que cerca de 7 milhões de pessoas no mundo estejam infectadas pelo T. cruzi. A Doença de Chagas pode resultar em morbidade grave e mortalidade. A distribuição dos triatomíneos principalmente na América Latina determina a prevalência da doença nessa área. Durante a alimentação sanguínea, o triatomíneo libera sua saliva no local da picada, a qual contém uma mistura complexa de compostos farmacologicamente ativos que evitam a hemostasia do hospedeiro e facilitam a ingestão de sangue. O objetivo deste estudo foi produzir uma serino protease semelhante a tripsina da saliva de Rhodnius neglectus (RnTryp) em sistema heterólogo de expressão procarioto e realizar sua caracterização funcional. O gene da RnTryp foi clonado no vetor de expressão pET_100/D-TOPO e a RnTryp recombinante (rRnTryp) foi expressa em Escherichia coli BL21(DE3). Após a purificação em coluna de afinidade ao níquel, SDS-PAGE e Western blotting foram realizados para confirmar a expressão da rRnTryp. A rRnTryp foi parcialmente purificada da fração bacteriana solúvel em tampão de eluição contendo de 80 a 200 mM de imidazol. A rRnTryp não foi capaz de hidrolisar o substrato fluorogênico Z-Phe Arg-AMC, substrato da calicreína, que atua na promoção da vasodilatação. Em conclusão, a rRnTryp foi enriquecida por cromatografia de afinidade e poderá ser utilizada em outros testes de atividade para a caracterização de suas funções na hematofagia e nas interações entre o vetor e o hospedeiro vertebrado.