Caracterização funcional de Rad53 de Cryptococcus neoformans

Abstract

Rad53 é uma proteína quinase presente em eucariontes que é fosforilada e ativada em resposta ao dano do DNA. Quando os eventos do ciclo celular são interrompidos, as proteínas do ponto de controle bloqueiam a progressão do ciclo celular até o processo de reparo do DNA ser concluído. Em Saccharomyces cerevisiae, Rad53 desempenha papéis importantes nas fases G1, S e G2 do ciclo celular, medeia a maioria das respostas após o dano ao DNA e está envolvido na tolerância à exposição a UV. Este trabalho, apresenta os dados relacionados à caracterização funcional de Rad53 em Cryptococcus neoformans. Não é um gene essencial, pois o mutante rad53Δ foi obtido por recombinação homóloga do marcador de resistência a Hygromicina B (HPH). A integração do marcador HPH no lócus RAD53 foi confirmada por PCR e Southern Blot. O mutante não apresentou defeito de crescimento em relação à alta temperatura, estresse oxidativo (H2O2), estresse osmótico (KCl, NaCl) e estresse da parede celular (Congo Red e Calcofluor white). Também foi avaliada a produção de fatores de virulência em rad53Δ como urease, fosfolipase, melanina e cápsula. A cápsula foi observada diminuída em comparação com a cepa do tipo selvagem. A resposta do mutante rad53Δ a estressores genotóxicos, incluindo hidroxiuréia (HU) que inibe a síntese de DNA, sulfato de metilmetano (MMS) que interrompe o ciclo celular devido à alquilação de DNA e radiação UV, também foram avaliadas. O mutante rad53Δ mostrou um defeito de crescimento em 0,04% de MMS, a 150 e 200 mM de HU e após exposição à radiação UV (60-360 J / m2) em comparação com o tipo selvagem. Quando as células não sincronizadas foram tratadas com MMS 0,04% por 1 h, a citometria de fluxo não detectou diferença na distribuição das células em relação às fases do ciclo celular ao comparar as linhagens H99 e rad53Δ. Entretanto, ao avaliar células sincronizadas e não tratadas com MMS, o mutante rad53Δ parece apresentar um atraso para retomada do ciclo celular, apresentando uma maior população de células em G2. Além disso, foi avaliada a susceptibilidade às drogas antifúngicas de rad53Δ, entretanto este não difere do seu selvagem H99, assim como no ensaio de sobrevivência após fagocitose por macrófagos M1. Assim, estes dados demonstram que Rad53 desempenha papel importante na resposta de C. neoformans aos agentes genotóxicos e sua ausência afeta a expressão de um dos fatores de virulência mais bem estudados neste fungo, a cápsula polissacarídica, indicando que a expressão de fatores de virulência e regulação do ciclo celular estão intimamente relacionadas.