Caracterização bioquímica e citolocalização de uma Serina/Treonina Fosfatase – PP2C de Trypanosoma cruzi

Abstract

A doença de Chagas apresenta o Trypanosoma cruzi como seu agente etiológico. Ao longo de seu ciclo de vida complexo, o parasita possui quatro formas principais de desenvolvimento: epimastigota, tripomastigota metacíclico, tripomastigota sanguíneo e amastigota. As manifestações clínicas da doença podem ser divididas em três fases: aguda, fase crônica indeterminada e fase crônica digestiva e/ou cardíaca. As formas de transmissão podem ser vetorial, por transfusão sanguínea, doação de órgãos sólidos, por alimentos e bebidas contaminados e outros. Atualmente o tratamento baseia-se nos medicamentos Benzonidazol e Nifurtimox. Existem diversas classes de proteínas implicadas na diferenciação celular e dentre elas podemos destacar as fosfatases. Para este trabalho foram propostas a clonagem, a expressão heteróloga, a purificação em coluna de Agarose/Níquel2+, a citolocalização em diferentes formas evolutivas e a caracterização bioquímica da proteína Serina/Treonina fosfatase- PP2C. A proteína TcPP2C foi expressa, na sua forma recombinante, na fração solúvel (3h a 20°C). Purificamos a proteína recombinante, sendo a TcPP2C eluída em uma concentração de 20-30mM de Imidazol. Testes de atividade enzimática para a TcPP2C com o substrato p-nitrofenilfosfato mostraram a proteína ativa somente na presença de íons divalentes, em maior grau na presença de manganês em comparação com magnésio. A enzima apresenta maior atividade na presença de DTT e a pH 7,5. Os ensaios de imunofluorescência indicam uma localização pontual da TcPP2C na forma epimastigota, difusa em amastigota e não identificada em tripomastigota. Esses dados experimentais mostraram que a enzima recombinante possui as características bioquímicas da subfamília PP2C importante para a sinalização celular, e que a nativa está presente nas formas de vida replicativas do T. cruzi. TcPP2C poderia estar principalmente envolvida nas vias de sinalização da divisão celular e da amastigogênese.